Горностай ведет одиночный территориальный образ жизни. Границы своего участка зверьки обязательно метят, а территория может быть довольно большой — от 10 до 20 гектаров. Самцы и самки живут раздельно и встречаются только во время брачного сезона.
В голодные годы горностаи покидают свои участки и переселяются порой на значительные расстояния. В такие времена животных иногда можно встретить и в городах — обычно недалеко от свалок и других мест, где водятся крысы. Именно грызуны преобладают в их рационе. Хотя может зверек питаться и другими мелкими животными, падалью и ягодами.

Активен горностай преимущественно в сумеречно-ночные часы. Это подвижное и ловкое животное: он хорошо плавает, легко забирается на деревья и перемещается по снегу. Если в округе не хватает пищи, зверек способен пройти до 15 километров. Несмотря на свои мелкие размеры, горностай смел и кровожаден — в случае крайней опасности может атаковать даже человека.
В выборе убежищ, в том числе и для выведения потомства, он неприхотлив. Самостоятельно нор не роет. Животное можно встретить в самых неожиданных местах: в стогах сена, кучах камней, в развалинах покинутых зданий или в бревнах, сложенных у стены жилого дома. Занимает горностай также норы убитых им грызунов, а в дуплах деревьев часто прячется при паводке. Зимой постоянных убежищ у зверька нет, так что он пользуется случайными укрытиями, причем очень редко возвращается в одно и то же место.