Иконостас Успенского собора был создан приблизительно в 1497 году одновременно со строительством каменного храма. XV век — классическая пора в развитии русского иконостаса. В это время в нем появляются новые ряды икон, он обретает удивительную архитектурную упорядоченность — и насчитывал почти 60 икон.
Наиболее ярко манера каждого из трех мастеров, создавших кирилловский иконостас, проявилась в написании праздничных икон. В иконах «Рождество Богоматери», «Введения Богоматери во храм», «Сретение» ярко ощущаются черты дионисиевского направления — одного из ведущих в московском искусстве конца XV — начала XVI века. Характерной особенностью почерка этого мастера являются яркие контрастные цвета — прежде всего, киноварь — яркий красный минеральный пигмент, и азурит — пигмент синего цвета, который ценился на вес золота. Росписи во многих храмах, посвященных Богородице, наполнены небесной синевой. Синий и голубой цвета означают бесконечность неба, символ иного, вечного мира и считаются цветами Богородицы, соединившей в себе и земное, и небесное. В создании икон «кирилловского» иконостаса художник использовал чистый азурит, без примеси других пигментов, а также добавлял в краску толчёное стекло, которое отталкивает свет, и увеличивает яркость синего цвета.
Пример работы «третьего» мастера успенского комплекса — икона «Уверение Фомы». Стиль этого иконописца отличает простая архаичная архитектура, яркие, но гармоничные цвета. Письмо ликов исполнено плотной золотистой охрой, что заметно отличает их от холодных, сильно высветленных ликов на иконах, принадлежащих «второму» мастеру.
В результате совместной работы иконописцев, связанных с разными художественными направлениями, возник грандиозный классический ансамбль древнерусской живописи. Иконостас Успенского собора Кирилло-Белозерского монастыря даёт представление о процессе формирования общерусского стиля иконописи на рубеже XV–XVI столетий.
С течением времени облик и устройство иконостаса менялись, появлялись и исчезали ряды икон. В середине XVI столетия серебряными позолоченными басменными окладами были закрыты иконы местного чина, а затем деисусного, праздничного и пророческого. Оклады были сделаны по мере поступления щедрых пожертвований, а также на деньги монастыря одной группой нанятых мастеров, использовавших монастырские матрицы. К концу XVI века сформировался пядничный ряд иконостаса, состоявший из небольших, размером в «пядь», то есть кисть руки, вкладных икон в драгоценных окладах. Позднее иконостас пополнился ещё одним рядом — праотеческим, в котором располагаются иконы ветхозаветных святых. В соборе также появились, частично заменив драгоценную басму, серебряные чеканные оклады на иконах местного ряда, выполненные царскими ювелирами.
Иконостасная конструкция XVIII века стилистически выдержана в переходных формах от барокко к классицизму. Иконостас по-прежнему насчитывает четыре яруса, но порядок рядов, в сравнении с первоначальным иконостасом, был изменен. Древний пророческий ряд к 1764 году был убран полностью, поскольку его широкие доски не вписывались в симметричную и однообразную структуру иконостаса. Полуфигурные изображения пророков разместились на тумбах под местными иконами в основании иконостасной конструкции. В завершении иконостаса в XIX веке поместили живописное Распятие с предстоящими и золочёные скульптуры ангелов.
Нижний ряд икон — местный. Он является самым непостоянным по составу. Здесь размещаются наиболее чтимые и подаренные государями образы с богатыми окладами. Помимо икон местный ряд включает в себя Царские врата, двери в дьяконник и жертвенник. Местный ряд после реконструкции иконостаса стал насчитывать восемь образов. Среди них — икона «Богоматерь Одигитрия», она располагается справа от Царских врат. Слева размещается образ Спасителя, за ним — храмовый образ «Успение Богоматери» («Облачный извод») конца XV века.
Третий ряд называется Деисусом, это ядро иконостасной композиции XV века. Основным его содержанием является тема Второго Пришествия, Страшного Суда и грядущего спасения человечества. В переводе с греческого «деиси́с» означает моление, прошение. В центральной части чина изображен Господь Вседержитель, восставший на Суд. По сторонам от Спасителя склонившиеся к Нему в молитве Богоматерь и Иоанн Креститель, архангелы Михаил и Гавриил, апостолы Пётр и Павел, следом за ними могли быть изображены другие святые, ходатайствующие о прощении грешников. Их расположение осуществлялось в определенной иерархии — архангелы, апостолы, святители, мученики, преподобные. Деисусный чин являет собой образ Небесной Церкви, пребывающей перед престолом Вседержителя в постоянных молитвах о спасении человеческого рода. Деисус иконостаса Успенского собора Кирилло-Белозерского монастыря сохранился полностью.
Масштабные исследования и реставрация икон Успенского собора Кирилло-Белозерского монастыря начали проводиться в 1960-е годы. Благодаря работе реставраторов уникальные памятники иконописи из Успенского собора были раскрыты и введены в научный оборот.
Реставрация иконостасной рамы была проведена в 2012–2013 годах. Художники-реставраторы научно-реставрационной мастерской провели работы по удалению загрязнений, плесени, толстого слоя спрессовавшейся пыли. Также удалось сохранить всю старинную позолоту. Склеивались и возвращались на место разломанные фрагменты резного декора.
