Иконография Флора и Лавра сложилась в XV веке. С середины XVI века, когда житие святых митрополит Макарий включил в книгу «Великие Минеи-Четьи», икона получила наибольшее распространение. 

Визуально образ делился на две части. В центре верхней части изображали Архангела Михаила с двумя запряжёнными лошадьми или без них. По сторонам от него на пригорках писали Флора и Лавра. Несмотря на то, что в жизни братья были близнецами, на иконах Флора пишут как человека средних лет, а Лавра — юношей. В нижней части иконы размещали лошадей.

Икона дополнена ещё тремя ликами святых мучеников — Спевсиппа, Елевсиппа и Мелевсиппа. Во II веке они разбили идолов в одном из языческих храмов. Им велели восстановить статуи и отречься от Христа. Однако святые этого не сделали, за что были жестоко казнены: сначала их растягивали между деревьев, а затем сожгли заживо. 

Мастера написали икону на доске. Чтобы она не деформировалась, с оборота доска скреплена шпонками — двумя узкими врезными дощечками. Лицевую сторону покрыли тонкой тканью — паволокой и несколькими слоями левкаса — смеси мела и клея. Изображение выполнили темперой — красками из порошковых пигментов и яичного желтка. Нимбы святых и архангела покрыли творёным золотом — краской с частичками этого драгоценного металла. 

Икона хранилась в имении Петровское под Рыбинском. После революции, когда усадьба опустела, сотрудники музея доставили в хранилище 45 старинных образов, в том числе эту икону.