Композиция картины построена в духе житийных икон XVII века: центральные фигуры святых окружают миниатюрные сцены, связанные с их жизнью. В таком же стиле Симаков создал полотна «Святые Антоний и Феодосий Печерские» и «Леонтий Ростовский». Как и на них, монументальные фигуры святых окружает лирический среднерусский пейзаж.

Хотя Борис и Глеб почитались как заступники русских князей, в народе им также приписывали чудеса целительства: считается, что множество случаев исцеления произошло у их гроба. В русской иконописи их образ распространился уже в XIII — начале XIV века. В это время была создана икона из Савво-Вишерского монастыря с одним из древнейших изображений Бориса и Глеба. Тогда же московский иконописец Дионисий изобразил святых братьев на фреске собора Рождества Богородицы Ферапонтова монастыря.